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发表于 2005-5-19 22:29:52
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[center]叶绿体蛋白质基因At4g18060酵母双杂交载体构建[/center]
摘要：生物细胞的生命活动由相互作用的蛋白质控制，我们通过酵母双杂交系统来研究蛋白质间的相互作用。本论文主要开展了酵母双杂交实验的前期工作，即叶绿体蛋白质相互作用的载体的构建。我们从已经构建好的叶绿体cDNA文库中挑选出一个基因At4g18060，通过PCR反应从质粒中扩增出该基因并连接到T载体，鉴定方向后，再酶切鉴定其大小，连接到pEG202与pJG4-5载体中。最后通过酶切鉴定插入片段大小正确，得到目的克隆。
关键词：叶绿体；蛋白质相互作用；酵母双杂交系统
Abstract: The life activities is controlled by protein interactions. We will try to study the protein interactions through yeast two-hybrid system. This thesis mainly expounded the formal basis of yeast two-hybrid experiment, that is, the construction of vector which is based on chloroplast- protein interactions. We choose Gene At4g18060 from the pre-built chloroplast cDNA libarary. We expanded this gene through PCR reaction and connected it to pMD 18-T Vector. After the identification of direction, the connected to the pEG202 and pJG4-5 vectors. Finally, we examined the constructed vector and succeeded.
Key words: chloroplast；protein-protein interaction；yeast two-hybrid system
1. 前言
1.1叶绿体功能
绿色植物能够将太阳能转化为化学能，叶绿体的主要功能是光合作用，同时在叶绿体中也合成DNA、RNA和各种蛋白质。叶绿体通常比线粒体大得多。有些单细胞植物，每个细胞只有一个大的叶绿体。但是，大多数植物细胞含有40多个较小的叶绿体，每一个叶绿体的长和粗都是一般线粒体的2～3倍。在叶绿体中有自己的rRNA、各种tRNA和mRNA，以及某些其他蛋白质合成因子。将叶绿体从细胞中分离出来，离体的叶绿体也能合成某些蛋白质。说明叶绿体有自己的蛋白质合成系统。叶绿体中的蛋白质（酶）一部分是在叶绿体中由它自己的DNA编码，经过mRNA转录和翻译形成的。另一部分则是由核DNA编码，在细胞质中形成后转入叶绿体。
1.2蛋白质相互作用
生物细胞的生命活动是由相互作用的蛋白质控制的，这些蛋白质参与代谢和信号传递通路以及组成复合体诸如合成和使用腺苷三磷酸(ATP)、复制和翻译基因或构成细胞骨架基础结构等等的分子机器。我们的蛋白质－蛋白质相互作用的知识从生物化学和遗传学实验中积累。也有研究表明，可以从基因组序列发现蛋白质的功能以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用。最普遍的方法则是通过酵母双杂交的方法来研究蛋白质－蛋白质相互作用。过去，科学家们因研究手段的限制，只能研究数个蛋白质之间的相互作用，而今天通过蛋白质组学的新方法，可以同时研究成千上万个蛋白质之间的相互作用。例如，芽殖酵母基因组全部ORF的表达产物――共6000多个多肽，彼此间可能存在的作用情况已进行了分析，从中发现了9百多种可能的相互作用，涉及到1000多个蛋白质。蛋白质组具有一个不同于基因组的重要特性，即蛋白质彼此间有着直接的影响。某一个蛋白质功能的实现，通常离不开它与其他蛋白质之间的相互作用。甚至可以说，不与其他蛋白质发生作用的“孤立蛋白质”根本就不存在。
1.3酵母双杂交系统
酵母双杂交系统是作为一个研究蛋白质-蛋白质相互作用的强大的工具出现的。它是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法，这个因子在DNA结合区与引起一套基因的转录增强的活化区紧密结合的部位。当蛋白质是被酵母细胞核里相互作用的两个ORFs所编码时，酵母双杂交系统是用融合到GAL4 的DNA的结合区（DNA binding domain，DNA-BD）或转录激活区（DNA activation domain，DNA-AD）的ORFs来增强一个通讯基因转录的结果。它的一个主要结果是一旦一个阳性的相互作用被发现，仅仅通过测序相关的克隆就能确定ORF。因为这些原因，它是一种普通的方法，它简单而且很适于作为高通量的蛋白质与蛋白质相互作用的筛选法。这里我们要讨论的仍是利用最普遍的方法——酵母双杂交系统来研究蛋白质－蛋白质相互作用。而该论文的主要目的则是提供酵母双杂交系统实验中的载体的构建。我们试图研究叶绿体中各种基因之间相互关系与影响，本实验从已经构建完成的叶绿体cDNA文库中挑选了At4g18060基因。在进行酵母双杂交实验前，需制备带有这个基因的载体。我们通过PCR反应从质粒中扩增出这个基因并接入T载体，鉴定方向后，再通过酶切鉴定大小，连接到pEG202与pJG4-5两个载体中，完成构建，最后再经电泳确定载体是否成功构建。此项实验为将来的酵母双杂交实验做了基础准备实验，为研究蛋白质的相互作用奠定了基础。
2．材料与方法
2.1材料
2.1.1材料
生态型Columbia(Col-0)拟南芥(Arabidopsis thaliana)
2.1.2载体
载体pMD 18-T Vector（50ng/µl） 购自TakaRa公司，转化E.Coli感受态菌株DH5α来自本实验室。
2.1.3工具酶和试剂
各种限制性内切酶 TakaRa公司、华美公司
T4DNA ligase TakaRa公司
各种抗生素 百泰公司
酵母提取粉 百泰公司
胰蛋白胨 百泰公司
琼脂糖 鼎国公司
DNA片段回收试剂盒 鼎国公司
pMD18-T Vector TakaRa公司
Taq DNA 聚合酶由本实验室制备
At4g18060上游引物[5' gggaattcATGATGGTCTCACTAGCT 3']
At4g18060下游引物[5' tgcggtcgacTTAGGAAGCAATGCGACG 3'] 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成
其它无机盐和常用化学试剂为国产分析纯试剂
2.1.4主要仪器
微量可调移液器P10、P100、P200、P1000 德国
水浴锅 上海恒科
恒温培养箱HZ-9211K 上海恒科
凝胶成像 上海天能
隔水式恒温培养箱 上海博迅
灭菌锅 上海博迅
超净工作台 上海博迅
超低温冰箱 日本SANYO
电击仪 德国
PTC-100 PCR仪 美国
电泳槽 华美、天能
电泳仪 天能
1612-1型高速离心机 上海金钟
台式低温高速离心机Z383K 德国HERMLE
2.2实验方法
2.2.1通过PCR反应从cDNA克隆中扩增出At4g18060 （681bp）基因。
1）PCR反应体系
在30µl 的总体系中，于0.2ml的PCR离心管中分别加入下列试剂：质粒2ul ；PCR缓冲液3ul ；dNTP 2ul ；上游引物1.5ul ；下游引物1.5ul ；Taq 1ul ；ddH2O 19ul 。混匀。
2）PCR反应程序
将反应的PCR离心管置于PCR仪中：
94℃预变性5 min；
94℃变性30s，52℃ 退火 30s，72℃延伸1min30s，循环次数为41个；
在72℃保持6min；
4 ℃保存。
3） PCR反应结束后，用2%的琼脂糖进行电泳，（电泳缓冲溶液用TAE缓冲液）紫外线观察仪下观察结果并利用Tanon GIS凝胶图像处理系统对凝胶扫描及拍照。
1X TAE配方：
40mmol/L Tris-乙酸
1mmol/L EDTA
2.2.2从琼脂糖中纯化/回收PCR产物
（1） 从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，放在1.5ml离心管中。
（2） 加入3倍体积的溶胶液，室温下放置5分钟或50℃保温3分钟，其间轻摇离心管几次使胶完全溶化。
（3） 加入10μL溶液B，将液体转入离心柱，10000rpm离心30秒，弃废液。
（4） 加500μL漂洗液，12000rpm离心30秒，弃废液。
（5） 重复步骤4，12000rmp离心2min, 弃废液，将离心柱置于新的离心管中，室温晾干，至酒精挥发完全。
（6） 加适量洗脱液， 50℃水浴2分钟，15000rpm离心1分钟，离下得所需片段。
2.2.318060-T载体的构建
10μL的反应体系中: 载体DNA 1μg
pMD 18-T Vector 0.5ul
ligation solutionⅠ 5ul
用ddH2O补足体积, 14-16℃连接过夜。
[center]图1：载体构建图
[/center]
2.2.4克隆载体的转化
1）将从-70℃冰箱中取出的感受态细胞放在冰上融化；
2）加入2μl的质粒，轻轻混匀内容物，冰浴30min；
3）将上述离心管放入预加温至42℃的水浴中30s；
4）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min；
5）每离心管中加800μl的SOC培养基，用水浴加温至37℃，然后将离心管放入37℃摇床中，180rpm培养45min；
6）取200μl培养物涂到有Amp 的LB平板（平板要求湿度适宜）中；37℃倒置培养，12-16h后可出现菌落。
2.2.5 PCR鉴定方向
将18060质粒分为三组，分组体系如下：
[left]第1组
[left]
[left]质粒2ul [/left]
[left]18060上游引物1.5ul[/left]
[left]18060下游引物1.5ul[/left]
[left]PCR buffer 3ul [/left]
[left]dNTP 2ul [/left]
[left]ddH2O 19ul [/left]
[left]Taq DNA聚合酶 1ul [/left]
[center][/center]
[/left]
[left]第2组[/left]
[left][/left]
[left]质粒2ul [/left]
[left]18060上游引物1.5ul [/left]
[left]M13下游引物1.5ul [/left]
[left]PCR buffer 3ul [/left]
[left]dNTP 2ul [/left]
[left]ddH2O 19ul [/left]
[left]Taq DNA聚合酶 1ul [/left]
[left]第3组[/left]
[left][/left]
[left]质粒2ul [/left]
[left]18060下游引物1.5ul [/left]
[left]M13下游引物1.5ul [/left]
[left]PCR buffer 3ul [/left]
[left]dNTP 2ul [/left]
[left]ddH2O 19ul [/left]
[left]Taq DNA聚合酶 1ul [/left]
[/left]
注：第一组为阳性对照。
PCR反应程序同前。电泳查看结果。
2.2.6酶切鉴定
At4g18060酶切：
在30ul 体系中： DNA 3ul
10*Hbuffer 3ul
EcoRⅠ 1ul
XhoⅠ 1ul
ddH2O 22ul
37 ℃水浴3小时，电泳，回收DNA片段，观察结果。
2.2.7 18060-202、18060-4-5载体构建
在15μL的体系中： 目的片段 6ul
pER8载体 2ul
10*T4 DNA Ligase Buffer 1ul
T4 DNA Ligase 1ul
ddH2O 5ul
EcoRⅠ，XhoⅠ双酶切鉴定
20μL的反应体系中: 质粒 3ul
10*Hbuffer 3ul
EcoRⅠ 1ul
XhoⅠ 1ul
ddH2O 12ul
37℃水浴3小时,电泳鉴定酶切结果。
3．结果与分析
3.1 PCR扩增At4g18060 （681bp）基因
我们从cDNA克隆中扩增出At4g18060 （681bp），通过PCR扩增并拍照后结果如图，从图2中可以看出PCR片段大约是681kb，与我们目的片段是一致的。
At4g18060（681bp）基因：
3.2连接T载体
按实验方法将目的片段接入pMD 18-T Vector，并做转化，隔日挑取单克隆并做PCR鉴定。在681bp左右出现目的片段，证明克隆转化成功。
3.3 PCR鉴定方向结果
At4g18060
如图3所示1号的片段大小约为681bp，2号无条带，3号有条带，根据方向鉴定的原理，可基本判定基因为正向插入
3.4酶切鉴定大小结果
如图4所示：酶切后，在大约681bp左右出现条带，与目的片段大小相同。证明该片段即为At4g18060。
3.5连接入pEG202、pJG4-5载体
18060-202（1-2），18060-45（3-5）
图6为PCR鉴定结果，在大约681bp左右处有条带出现。
3.6 At4g18060-202和At4g18060-45的酶切鉴定
如图5所示，经过酶切鉴定后，发现在大约681bp左右处，有条带，与目的片段一致，表示构建成功。
4．讨论
本实验载体构建为酵母双杂交实验的基础实验，为其奠定了基础。通过该实验学到了许多技术和知识，如PCR，DNA基因克隆技术，方向鉴定技术，酶切技术等等。通过此次实验成功构建了At4g18060-202，At4g18060-45载体。
载体构建完成后，即可进行酵母双杂交实验。酵母双杂交实验在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。酵母双杂交技术可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。
参考文献
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[8] [美]I. 阿西莫夫 著 王爱琴 译 阿西莫夫最新科学指南·蛋白质
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