【小哀科学院】6.1(395楼)更新 Synthia过不过儿童节？

Aquavit

研究报告还有很多部分没写，光是实验都没时间做完，却还生病了......

我一般都是详细写理论和RESULT部分，其他的都是在短时间内完成然后拿到秘书那里改一些文法错误(你不能指望我既是个专家又是莎士比亚啊~~而且秘书是精通文法且品德很好的事务专家，绝对不会偷研究成果的^^)。大部分人也都是只看看结果部分，其他的稍微看一点。我自己读论文从来都不读什么背景介绍之类~~更迅速阅读新研究结果的办法就是参加实验室下午的茶会，点心都很好吃^^

reba_lee

[center]此贴严禁任何形式转载[/center]
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[center]叶绿体蛋白质基因At4g18060酵母双杂交载体构建[/center]





摘要：生物细胞的生命活动由相互作用的蛋白质控制，我们通过酵母双杂交系统来研究蛋白质间的相互作用。本论文主要开展了酵母双杂交实验的前期工作，即叶绿体蛋白质相互作用的载体的构建。我们从已经构建好的叶绿体cDNA文库中挑选出一个基因At4g18060，通过PCR反应从质粒中扩增出该基因并连接到T载体，鉴定方向后，再酶切鉴定其大小，连接到pEG202与pJG4-5载体中。最后通过酶切鉴定插入片段大小正确，得到目的克隆。

关键词：叶绿体；蛋白质相互作用；酵母双杂交系统



Abstract: The life activities is controlled by protein interactions. We will try to study the protein interactions through yeast two-hybrid system. This thesis mainly expounded the formal basis of yeast two-hybrid experiment, that is, the construction of vector which is based on chloroplast- protein interactions. We choose Gene At4g18060 from the pre-built chloroplast cDNA libarary. We expanded this gene through PCR reaction and connected it to pMD 18-T Vector. After the identification of direction, the connected to the pEG202 and pJG4-5 vectors. Finally, we examined the constructed vector and succeeded.



Key words: chloroplast；protein-protein interaction；yeast two-hybrid system



1.     前言



1.1叶绿体功能



绿色植物能够将太阳能转化为化学能，叶绿体的主要功能是光合作用，同时在叶绿体中也合成DNA、RNA和各种蛋白质。叶绿体通常比线粒体大得多。有些单细胞植物，每个细胞只有一个大的叶绿体。但是，大多数植物细胞含有40多个较小的叶绿体，每一个叶绿体的长和粗都是一般线粒体的2～3倍。在叶绿体中有自己的rRNA、各种tRNA和mRNA，以及某些其他蛋白质合成因子。将叶绿体从细胞中分离出来，离体的叶绿体也能合成某些蛋白质。说明叶绿体有自己的蛋白质合成系统。叶绿体中的蛋白质（酶）一部分是在叶绿体中由它自己的DNA编码，经过mRNA转录和翻译形成的。另一部分则是由核DNA编码，在细胞质中形成后转入叶绿体。



1.2蛋白质相互作用



生物细胞的生命活动是由相互作用的蛋白质控制的，这些蛋白质参与代谢和信号传递通路以及组成复合体诸如合成和使用腺苷三磷酸(ATP)、复制和翻译基因或构成细胞骨架基础结构等等的分子机器。我们的蛋白质－蛋白质相互作用的知识从生物化学和遗传学实验中积累。也有研究表明，可以从基因组序列发现蛋白质的功能以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用。最普遍的方法则是通过酵母双杂交的方法来研究蛋白质－蛋白质相互作用。过去，科学家们因研究手段的限制，只能研究数个蛋白质之间的相互作用，而今天通过蛋白质组学的新方法，可以同时研究成千上万个蛋白质之间的相互作用。例如，芽殖酵母基因组全部ORF的表达产物――共6000多个多肽，彼此间可能存在的作用情况已进行了分析，从中发现了9百多种可能的相互作用，涉及到1000多个蛋白质。蛋白质组具有一个不同于基因组的重要特性，即蛋白质彼此间有着直接的影响。某一个蛋白质功能的实现，通常离不开它与其他蛋白质之间的相互作用。甚至可以说，不与其他蛋白质发生作用的“孤立蛋白质”根本就不存在。



1.3酵母双杂交系统



酵母双杂交系统是作为一个研究蛋白质-蛋白质相互作用的强大的工具出现的。它是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法，这个因子在DNA结合区与引起一套基因的转录增强的活化区紧密结合的部位。当蛋白质是被酵母细胞核里相互作用的两个ORFs所编码时，酵母双杂交系统是用融合到GAL4 的DNA的结合区（DNA binding domain，DNA-BD）或转录激活区（DNA activation domain，DNA-AD）的ORFs来增强一个通讯基因转录的结果。它的一个主要结果是一旦一个阳性的相互作用被发现，仅仅通过测序相关的克隆就能确定ORF。因为这些原因，它是一种普通的方法，它简单而且很适于作为高通量的蛋白质与蛋白质相互作用的筛选法。这里我们要讨论的仍是利用最普遍的方法——酵母双杂交系统来研究蛋白质－蛋白质相互作用。而该论文的主要目的则是提供酵母双杂交系统实验中的载体的构建。我们试图研究叶绿体中各种基因之间相互关系与影响，本实验从已经构建完成的叶绿体cDNA文库中挑选了At4g18060基因。在进行酵母双杂交实验前，需制备带有这个基因的载体。我们通过PCR反应从质粒中扩增出这个基因并接入T载体，鉴定方向后，再通过酶切鉴定大小，连接到pEG202与pJG4-5两个载体中，完成构建，最后再经电泳确定载体是否成功构建。此项实验为将来的酵母双杂交实验做了基础准备实验，为研究蛋白质的相互作用奠定了基础。



2．材料与方法

2.1材料

2.1.1材料

生态型Columbia(Col-0)拟南芥(Arabidopsis thaliana)



2.1.2载体

载体pMD 18-T Vector（50ng/µl） 购自TakaRa公司，转化E.Coli感受态菌株DH5α来自本实验室。



2.1.3工具酶和试剂

各种限制性内切酶              TakaRa公司、华美公司

T4DNA ligase                   TakaRa公司

各种抗生素                    百泰公司

酵母提取粉                    百泰公司

胰蛋白胨                      百泰公司

琼脂糖                        鼎国公司

DNA片段回收试剂盒           鼎国公司

pMD18-T Vector                TakaRa公司

Taq DNA 聚合酶由本实验室制备

At4g18060上游引物[5' gggaattcATGATGGTCTCACTAGCT 3']

At4g18060下游引物[5' tgcggtcgacTTAGGAAGCAATGCGACG 3'] 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成

其它无机盐和常用化学试剂为国产分析纯试剂



2.1.4主要仪器

微量可调移液器P10、P100、P200、P1000     德国

水浴锅                                    上海恒科

恒温培养箱HZ-9211K                       上海恒科

凝胶成像                                   上海天能

隔水式恒温培养箱                           上海博迅

灭菌锅                                     上海博迅

超净工作台                                 上海博迅

超低温冰箱                                 日本SANYO

电击仪                                     德国

PTC-100 PCR仪                             美国

电泳槽                                     华美、天能

电泳仪                                     天能

1612-1型高速离心机                         上海金钟

台式低温高速离心机Z383K　　　　　　　   　德国HERMLE



2.2实验方法

2.2.1通过PCR反应从cDNA克隆中扩增出At4g18060 （681bp）基因。

1）PCR反应体系

在30µl 的总体系中，于0.2ml的PCR离心管中分别加入下列试剂：质粒2ul ；PCR缓冲液3ul ；dNTP 2ul ；上游引物1.5ul ；下游引物1.5ul ；Taq 1ul ；ddH2O 19ul 。混匀。



2）PCR反应程序

   将反应的PCR离心管置于PCR仪中：

94℃预变性5 min；

94℃变性30s，52℃ 退火 30s，72℃延伸1min30s，循环次数为41个；

在72℃保持6min；

4 ℃保存。



3）  PCR反应结束后，用2%的琼脂糖进行电泳，（电泳缓冲溶液用TAE缓冲液）紫外线观察仪下观察结果并利用Tanon GIS凝胶图像处理系统对凝胶扫描及拍照。

  1X TAE配方：

40mmol/L Tris-乙酸

1mmol/L EDTA



2.2.2从琼脂糖中纯化/回收PCR产物

（1）    从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，放在1.5ml离心管中。

（2）    加入3倍体积的溶胶液，室温下放置5分钟或50℃保温3分钟，其间轻摇离心管几次使胶完全溶化。

（3）    加入10μL溶液B，将液体转入离心柱，10000rpm离心30秒，弃废液。

（4）    加500μL漂洗液，12000rpm离心30秒，弃废液。

（5）    重复步骤4，12000rmp离心2min, 弃废液，将离心柱置于新的离心管中，室温晾干，至酒精挥发完全。

（6） 加适量洗脱液， 50℃水浴2分钟，15000rpm离心1分钟，离下得所需片段。

2.2.318060-T载体的构建

10μL的反应体系中:    载体DNA              1μg

                        pMD 18-T Vector         0.5ul

                        ligation solutionⅠ        5ul

用ddH2O补足体积, 14-16℃连接过夜。










[center]图1：载体构建图








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2.2.4克隆载体的转化

1）将从-70℃冰箱中取出的感受态细胞放在冰上融化；

2）加入2μl的质粒，轻轻混匀内容物，冰浴30min；

3）将上述离心管放入预加温至42℃的水浴中30s；

4）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min；

5）每离心管中加800μl的SOC培养基，用水浴加温至37℃，然后将离心管放入37℃摇床中，180rpm培养45min；

6）取200μl培养物涂到有Amp 的LB平板（平板要求湿度适宜）中；37℃倒置培养，12-16h后可出现菌落。



2.2.5 PCR鉴定方向

将18060质粒分为三组，分组体系如下：









[left]第1组




[left]



[left]质粒2ul [/left]

[left]18060上游引物1.5ul[/left]

[left]18060下游引物1.5ul[/left]

[left]PCR buffer 3ul [/left]

[left]dNTP 2ul [/left]

[left]ddH2O 19ul [/left]

[left]Taq DNA聚合酶 1ul [/left]
[center][/center]



[/left]




[left]第2组[/left]
[left][/left]


[left]质粒2ul [/left]

[left]18060上游引物1.5ul [/left]

[left]M13下游引物1.5ul [/left]

[left]PCR buffer 3ul [/left]

[left]dNTP 2ul [/left]

[left]ddH2O 19ul [/left]

[left]Taq DNA聚合酶 1ul [/left]









[left]第3组[/left]
[left][/left]


[left]质粒2ul [/left]

[left]18060下游引物1.5ul [/left]

[left]M13下游引物1.5ul [/left]

[left]PCR buffer 3ul [/left]

[left]dNTP 2ul [/left]

[left]ddH2O 19ul [/left]

[left]Taq DNA聚合酶 1ul [/left]





            

[/left]



注：第一组为阳性对照。

PCR反应程序同前。电泳查看结果。



2.2.6酶切鉴定

    At4g18060酶切：

在30ul 体系中：    DNA                   3ul

10*Hbuffer             3ul

EcoRⅠ                1ul

XhoⅠ                 1ul

ddH2O                22ul

37 ℃水浴3小时，电泳，回收DNA片段，观察结果。

2.2.7 18060-202、18060-4-5载体构建

在15μL的体系中：    目的片段               6ul

                      pER8载体                   2ul

            10*T4 DNA Ligase Buffer            1ul

                      T4 DNA Ligase           1ul

                      ddH2O                  5ul

EcoRⅠ，XhoⅠ双酶切鉴定

20μL的反应体系中:     质粒                  3ul

                      10*Hbuffer              3ul

                       EcoRⅠ                1ul

                       XhoⅠ                 1ul

                       ddH2O                12ul

  37℃水浴3小时,电泳鉴定酶切结果。

3．结果与分析

3.1 PCR扩增At4g18060 （681bp）基因

我们从cDNA克隆中扩增出At4g18060 （681bp），通过PCR扩增并拍照后结果如图，从图2中可以看出PCR片段大约是681kb，与我们目的片段是一致的。

At4g18060（681bp）基因：







3.2连接T载体

按实验方法将目的片段接入pMD 18-T Vector，并做转化，隔日挑取单克隆并做PCR鉴定。在681bp左右出现目的片段，证明克隆转化成功。

3.3 PCR鉴定方向结果

At4g18060



如图3所示1号的片段大小约为681bp，2号无条带，3号有条带，根据方向鉴定的原理，可基本判定基因为正向插入

3.4酶切鉴定大小结果


如图4所示：酶切后，在大约681bp左右出现条带，与目的片段大小相同。证明该片段即为At4g18060。

3.5连接入pEG202、pJG4-5载体

18060-202（1-2），18060-45（3-5）





图6为PCR鉴定结果，在大约681bp左右处有条带出现。



3.6 At4g18060-202和At4g18060-45的酶切鉴定




如图5所示，经过酶切鉴定后，发现在大约681bp左右处，有条带，与目的片段一致，表示构建成功。



4．讨论

本实验载体构建为酵母双杂交实验的基础实验，为其奠定了基础。通过该实验学到了许多技术和知识，如PCR，DNA基因克隆技术，方向鉴定技术，酶切技术等等。通过此次实验成功构建了At4g18060-202，At4g18060-45载体。

载体构建完成后，即可进行酵母双杂交实验。酵母双杂交实验在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。酵母双杂交技术可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。





参考文献

[1] Edward M. Marcotte, Matteo Pellegrini, Ho-Leung Ng,Danny W. Rice, Todd O. Yeates, David Eisenberg 从基因组序列发现蛋白质功能和蛋白质之间的相互作用 Science，1999, 285( 5428), 751-753.

[2] ZHANG xiao-guang et.al  Yeast two-hybrid system and its applications  Chinese Bulletin of Life Sciences 13(2001)228-231

[3] Akhilesh Pandey & Matthias Mann   Proteomics to study genes and genomes  Nature 405(2000)837-846

[4] 朱鹏程 桑瑛颖 徐人尔 赵璟 李晶本 赵寿元   ADAM22蛋白与14-3-3蛋白之间的相互作用  中国科学（c辑）2002；32(3)276-281

[5] 徐东刚 马百坤 李莉 邹民吉 彭善云 王嘉玺 血管生成素相互作用蛋白的发现及其在哺乳动物细胞中的验证  生物化学与生物物理进展 2002；29(3)429-433

[6] J．萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔 著  黄培堂 等 译   分子克隆实验指南（第三版）

[7] 郝水，张传善，傅萍，郑易之，牛怡聪编著  叶绿体分子遗传学 湖南科学科技出版社

[8] [美]I. 阿西莫夫　著　王爱琴 译   阿西莫夫最新科学指南·蛋白质

panzerVI

赞～登刊了么？还是新近的？

飘去更新标题～～

reba_lee

嗯，我的毕业论文而已……

所以不是刊登在什么刊物上的文章……

panzerVI

这样啊～好精练的^_^～偶还跑去检索了一番(汗～并非恶意搜集网友信息)

偶的毕业论文还没搭起来（做的蛋白质三维结构同源建模(部分内行人好像更喜欢叫“模建”啊～汗)）……之前Boss却迫害偶GGYY了两篇5k+的文献综述……现在还要重新凑15k起来～哭死～～～希望月底前能搞定～

reba_lee

[QUOTE=sammy_W909009]= =

这个能登在柯哀的月刊上么……[/QUOTE]


暂时不要吧……

我怕学校找我麻烦%&051

reba_lee

[QUOTE=panzerVI]这样啊～好精练的^_^～偶还跑去检索了一番(汗～并非恶意搜集网友信息)

偶的毕业论文还没搭起来（做的蛋白质三维结构同源建模(部分内行人好像更喜欢叫“模建”啊～汗)）……之前Boss却迫害偶GGYY了两篇5k+的文献综述……现在还要重新凑15k起来～哭死～～～希望月底前能搞定～[/QUOTE]


汗，我们这个实验做起来麻烦- -0弄了好几个月

虽然到最后写的东西很精练……

yj1983

我们的论文么，老师给出的指令是5号字打印的40页纸，估计将长达25K左右……

reba_lee

[QUOTE=杰洛士]大惊……[/QUOTE]


你大惊个什么？

reba_lee

[QUOTE=yj1983]我们的论文么，老师给出的指令是5号字打印的40页纸，估计将长达25K左右……[/QUOTE]


呵呵，研究生论文……
- -0

这么多……

Aquavit

25K.....真幸福，我是最少30页的Lab Note(听说某人曾经写了80页~~)，至于研究报告估计不会少于15页~~考虑到在NATURE上发表的时候能剩下3页就很满足了(汗，我认识的一个在伦敦的家伙被告知他的论文要发表只能剩下一页~~~~)

参考文献很少啊。没问题么？......像我的BOSS每次都要我写N页的reference~~

反正我这儿学期还长着呢，不着急(飘走的老头子)

PS，贵国实验室的报告不需要写一份实验预算吗？

d_dog

^^

登了就好

希望大家能尽兴讨论

算是我对科学院的一些支持

PS：丫头。参考文献少了点………真的……

reba_lee

[QUOTE=d_dog]^^

登了就好

希望大家能尽兴讨论

算是我对科学院的一些支持

PS：丫头。参考文献少了点………真的……[/QUOTE]


我不注重形式主义啊

写那么多我没看过的文献……%&051

难道我太诚实了，看过多少写多少？

reba_lee

要文献还不简单……

只不过，看不了这么多，呵呵

panzerVI

[QUOTE=yj1983]我们的论文么，老师给出的指令是5号字打印的40页纸，估计将长达25K左右……[/QUOTE]
偶到没收到Boss如此的直接指令……8过统一的那个论文要求文档居然就GGYY了20页@_@
貌似之前有个写了22k的已经被T回来了～前两天还有个做SVM的在版上哭～其实做理论的相对还简单啊(偶的也算是XD，比起做MIS啊或者网站什么的)，给的分还高^^不过不知道这毕业论文的分高到底又多大价值……

reba_lee

[QUOTE=拉克丝·库莱茵]我们所要求的文献的标准：
1。必须看过你所摘录的文献
2。必须对你所摘录的文献段落作一个概括，并在文章内用数字标明
3。在答辩的时候[老师偷偷告诉我的]，必须对自己所摘录的文献有一个大致的说明，会有一个专门的老师来审查的……[/QUOTE]


您慢慢看……

reba_lee

[QUOTE=拉克丝·库莱茵]%&072 我都看过了啊，不然怎么写综述……
还有毕业论文呢，正头大中[/QUOTE]

痛苦的人啊


可怜我当时也很痛苦，现在算是脱离苦海

可惜这种事情除了本人以外，别人爱莫能助呢

找老师帮帮忙吧

panzerVI

……这里好像已经成了毕业论文讨论专场-_-

发现同个导师带的一位老兄正在系版上哭求……可惜偶打算让他自生自灭……哎呀～偶好残酷哦～XDXD

d_dog

- -

虎仔。。。。。我听到你的奸笑声了。。。。。XDXD

panzerVI

现在暂时对调戏本系同学没什么兴趣啊……因为……好困……接着睡去- -

PS：奸笑……？是奸笑么……？